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      论文:鸡蛋清水解物对亚硫酸钠诱发的 疲劳斑马鱼的改善作用

      • 王 玉 刘采云
      • 1216
      • 2020-11-16 16:37:24

      (1    *南京蛋生生物科技研究院,南京211800;)(2.上海理工大学食品科学与工程研究所,上海 200082;)

      摘要:本实验研究了鸡蛋清水解物(HEpep)对斑马鱼的疲劳改善作用。将斑马鱼随机分为6组,分别为空白对照组(养育用水处理)、疲劳模型对照组、中华跌打丸组以及3个HEpep浓度组。28℃培养箱中培养一段时间后,除空白对照组外,其余组均同时水溶给予亚硫酸钠以诱发斑马鱼疲劳模型,然后水溶给予中华跌打丸(1 mg/mL)处理阳性对照组,分别以水溶给予111, 333和1000 μg/mL浓度的HEpep处理HEpep剂量组。养鱼一段时间后,利用行为分析仪测定斑马鱼的运动总距离,并用凝胶渗透色谱测定了HEpep的分子量以及氨基酸含量。结果显示:HEpep分子量668以及303的肽段占比最大,分别占25%以及48%;必需氨基酸占氨基酸总量接近36%,必需氨基酸与非必需氨基酸比例为0.56;支链氨基酸(亮氨酸+异亮氨酸+缬氨酸)含量丰富,高达15.93 mg/g。与疲劳模型对照组比较,中华跌打丸组运动改善作用为115.2%; 在 111、333和1000 μg/mL浓度的浓度条件下,其运动改善作用分别为72.5%、16.9% 和1.9%,乳酸含量分别降低63.2%、18.8%和5.1%。该结果表明,HEpep对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼运动能力有明显的改善作用,可以显著性降低斑马鱼体内乳酸含量。HEpep作为疲劳改善剂使用时,推荐适宜浓度范围为 0–111 μg/mL。

      关键词:鸡蛋清水解物氨基斑马鱼疲劳

      Improvement of Egg White Hydroysate on Fatigue

      Zebrafish Induced by Sodium Sulfite

      WANG Yu1*, LIU Caiyun2

      (1*.Nanjing Egg Biotechnology Research Institute, Nanjing 211800, China) (2.School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China;)

       

      Abstract: Effect of egg white hydroysate (HEpep) on fatigue zebrafish induced by sodium sulfite was investigated. Zebrafish were randomly divided into six groups: blank group, fatigue model group, Zhonghua Dieda pill group and three concentrations of HEpep group. After incubation at 28℃, except for the blank group, all the other groups were treated by sodium sulfite to induce zebrafish fatigue model. Then Zhonghua Dieda pill at a dose of 1 mg/mL, and HEpep at doses of 111, 333 and 1000 μg/mL was used to treat the fatigue zebrafish respectively. After incubation, the total movement distance of zebrafish was measured by behavior analyzer. The molecular weight and amino acid content of HEpep were also measured. Results showed that molecular weight of 668 and 303 in HEpep accounted for the largest, 25% and 48% respectively; The proportion of essential amino acids to total amino acids was close to 36%, the proportion of essential amino acids to non-essential amino acids was 0.56, branched chain amino acids (Leu + Ile + Val) were rich in HEpep, up to 15.93 mg/g. The total movement distance of zebrafish in Zhonghua Dieda pill group was 115.2% of improvement compared with the model group; In the group treated by HEpep at doses of 111, 333 and 1000 μg/mL, the improvement rate of movement distance was 72.5%, 16.9% and 1.9% respectively, the decrease rate of lactic acids content was 63.2%18.8% and 5.1% respectively. The results indicated that HEpep could significantly improve the exercise ability and decrease lactic acid content of fatigue zebrafish induced by sodium sulfite. The optimum concentration of HEpep is 0 – 111 μg/mL when it’s used as a fatigue improver. 

      Key words: egg white hydrolysate; amino acid;zebrafish; fatigue

       

      通讯作者:王玉,1990年生,女,博士研究生,研究方向:鸡蛋生物功能性开发、特医食品研究与开发。

      疲劳是持久或过度劳累后造成的身体不适及工作效率减退的现象[1]。长期以来众多学者期望能寻找到一种安全、有效、无毒副作用的方法来有效的延缓疲劳的发生和加速疲劳的消除[2]

      鸡蛋清蛋白质氨基酸模式与人体的最接近,生物利用率高,被认为是蛋白质的理想来源。蛋清蛋白经过一种或多种酶水解后形成具有生物活性的肽段,可在食品工业和医药行业方面发挥极大作用[3,4]。目前发现的鸡蛋中的生物活性肽包括降血压肽、抗菌肽、抗氧化肽、免疫调节肽以及促进脑部健康肽等[5-9]

      斑马鱼是一种新型模式脊椎动物,具有繁殖能力强、生殖周期短、胚胎透明、能在显微镜下进行实时观察等特点。其基因与人类基因有着87%的相似性,它们的编码蛋白结构相似而且在生物体内发挥类似的功能、被美国食品药品监督管理局列为继人和啮齿类鼠之后的第三大模式生物,已广泛应用于生命科学研究[10-11]

      本研究利用行为分析仪测定斑马鱼的运动总距离,以统计学意义确定了HEpep对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼运动的改善作用, 旨在探索鸡蛋清水解物的新的应用方向。

      1  材料与方法 

      1.1  原料 

      斑马鱼(品种:野生AB系)HEpep(厚德食品股份有限公司)亚硫酸钠NaOH溶液、柠檬酸(阿拉丁试剂(上海)有限公司);中华跌打丸(广西梧州制药(集团)股份有限公司;乳酸测定试剂盒 (南京建成生物工程研究所)

      1.2  主要仪器设备 

      V3行为分析仪 ViewPoint Life SciencesSPX-250B-Z生化培养箱 博迅实业;Waters 1525高效液相色谱仪;L-8900全自动氨基酸分析仪 日本日立公司;

      1.3  试验方法    

      1.3.1 HEpep的制备工艺

      HEpep制备工艺:蛋清蛋白酶解酶解液膜分离浓缩喷雾干燥蛋清蛋白肽。

      1.3.2 HEpep分子量大小的测定

      HEpep分子量大小的测定采用Waters 1525高效液相色谱仪(配2487紫外检测器和Empower工作站GPC软件),色谱柱为TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm、流动相为乙腈//三氟乙酸= 45/55/0.1V/V/V)、检测波长为220 nm、流速为0.5 ml/min、柱温为 30℃。

      1.3.3 HEpep氨基酸含量的测定

      氨基酸含量:用日立L-8900全自动氨基酸分析仪测定

      1.3.4 斑马鱼仔鱼的准备

      斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质:每1L反渗透水中加入200 mg速溶海盐,电导率为 480~510 μS/cmpH6.9~7.2;硬度为53.7~71.6 mg/L CaCO3),实验动物使用许可证号为:SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。

      野生型AB品系斑马鱼,以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后4天(4 dpf),共180尾,每实验组为30尾,用于确定HEpep抗疲劳作用的最大检测浓度(MTC)。野生型AB品系斑马鱼,以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后4天(4 dpf),共180尾,每实验组为30尾,用于HEpep抗疲劳作用评价。

      1.3.5 确定HEpep的最大检测浓度(MTC

      随机选取180尾受精后4天(4 dpf)野生型AB品系斑马鱼,每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼,分别水溶给予HEpep 250500100020004000 μg/mL浓度,同时设置正常对照组(即养鱼用水处理斑马鱼),每孔(实验组)容量为5 mL,置于28℃培养箱中培养1天至5 dpf。实验结束后,观察记录斑马鱼的死亡数量和毒性情况,确定HEpep对斑马鱼的最大检测浓度(MTC)。

      1.3.6 HEpep对斑马鱼运动的影响

      随机选取180尾受精后4天(4 dpf)野生型AB品系斑马鱼,每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼,分别水溶给予HEpep 1113331000 μg/mL浓度,阳性对照药中华跌打丸1 mg/mL浓度,同时设置正常对照组(即养鱼用水处理斑马鱼)和模型对照组,每孔(实验组)容量为5 mL28℃培养箱中培养1天至5dpf后,除正常对照组外,其余实验组均用8 mg/mL亚硫酸钠处理5 dpf斑马鱼20 min,以诱发斑马鱼疲劳模型。

      HEpep和亚硫酸钠共同处理斑马鱼20 min后,每个实验组随机选取10尾斑马鱼,利用行为分析仪,测定斑马鱼的运动总距离(S),以统计学意义评价HEpep对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼运动的改善作用。

      HEpep对斑马鱼运动能力改善作用计算公式如下:

      运动能力改善作用(%=SSM/( SCSM)*100%

      S:供试品组;SM:模型对照组;SC:正常对照组

      1.3.7 运动后斑马鱼乳酸含量测定[12]

      用乳酸测试盒按步骤加样后可见光分光光度计测其吸光值(波长530 nm), 制作乳酸含量的标准曲线。在低温环境中,将运动后的模型斑马鱼、阳性对照组(用中华跌打丸处理)以及HEpep 3个浓度(111, 3331000 μg/mL)处理后的斑马鱼用10倍生理盐水制成匀浆液,离心后取上清液稀释5倍后测其吸光值(波长530 nm),通过标准曲线计算得出的匀浆稀释液乳酸浓度(mmol/ L),换算后即得斑马鱼体内乳酸浓度。

      乳酸含量减少率(%=(模型斑马鱼乳酸浓度-处理后斑马鱼)/模型斑马鱼乳酸浓度*100%

      1.3.8数据处理

      用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析,p < 0.05表明具有显著性差异。

      2  结果与讨论

      2.1      HEpep的分子量

      鸡蛋清水解物HEpep的分子量检测结果如图1所示。从表1中可知,分子量为668以及303的肽段占比最大,分别占25%以及48%


      clip_image002.gif

      1 HEpep的凝胶渗透色谱图  

      Fig.1 Analytical results of HEpep by GPC chromatopgraphy.

       

      1 HEpep的凝胶渗透色谱分析结果

      Table 1 Analytical results of HEpep by GPC chromatopgraphy

      峰号

      Peak No.

      RTmin

      Mn

      Mw

      MP

      面积

      Area

      含量

      Content(%)

      1

      11.41

      20486

      20976

      22377

      1991613

      3.00

      2

      14.10

      6297

      6488

      4985

      555242

      0.84

      3

      15.00

      3651

      3721

      3016

      1653643

      2.49

      4

      15.73

      2424

      2458

      2003

      2378215

      3.59

      5

      16.98

      1321

      1378

      997

      5885551

      8.88

      6

      18.08

      645

      668

      540

      16723966

      25.22

      7

      19.48

      279

      303

      248

      31861485

      48.05

      8

      20.05

      117

      134

      180

      5256213

      7.93

       

      2.2 HEpep的氨基酸含量检测结果

      本研究对鸡蛋清水解物HEpep的氨基酸含量进行了分析,结果如表2所示。可以看出,HEpep必需氨基酸占氨基酸总量的36%,而且必需氨基酸是非必需氨基酸的0.56倍。根据FAO/WHO理想蛋白模式中,必需氨基酸应该氨基酸总量的40%左右,且必需氨基酸应非必需氨基酸的0.60倍。由此可以得出HEpep的氨基酸模式非常接近FAO/WHO对理想蛋白质的规定,而且HEpep中氨基酸含量高达127.68 mg/g,说明HEpep可以作为一种理想的蛋白质来源。另外,HEpep中支链氨基酸(亮氨酸+异亮氨酸+缬氨酸)的含量高达15.93 mg/g

      2 HEpep的氨基酸含量检测结果

      Table 2 Amino Acid Composition of HEpep

      名称

      氨基酸含量 mg/g

      氨基酸总量T mg/g

      必需氨基酸含量/氨基酸总量 %

      非必需氨基酸含量/氨基酸总量 %

      天冬氨酸

      27.6

      127.68

      35.92

      64.08

      苏氨酸*

      4.47

      丝氨酸

      7.15

      谷氨酸

      18.75

      甘氨酸

      3.86

      丙氨酸

      7.72

      蛋氨酸 *

      4.13

      异亮氨酸*

      5.09

      亮氨酸*

      9.46

      酪氨酸

      4.5

      苯丙氨酸*

      9.38

      赖氨酸

      6.62

      组氨酸

      2.61

      精氨酸

      5.79

      脯氨酸

      3.84

      缬氨酸*

      6.71

      *表示人体必需氨基酸

      2.3 HEpep浓度对斑马鱼死亡率的影响

      3表明了HEpep处理后斑马鱼浓度-死亡率的实验结果,由表3可知HEpep2501000 μg/mL浓度下,未引起斑马鱼死亡,也未见其他明显的毒性表型;然而在20004000 μg/mL浓度下,分别诱发11/3030/30尾斑马鱼死亡,死亡率分别为36.7%100%,故确定HEpep对斑马鱼抗疲劳作用的最大检测浓度为1000 μg/mL,因此抗疲劳作用正式实验浓度设置为1113331000 μg/mL

       

      3 HEpep 处理后斑马鱼浓度-死亡率实验结果(n=30

      Table 3 “Concentration- death rate ” result of zebrafish treated by HEpepn=30

      组别

      浓度(μg/mL

      死亡数(尾)

      死亡率(%

      毒性反应情况

      正常对照组

      -

      0/30

      0

      未见明显异常

      HEpep

      250

      0/30

      0

      未见明显异常

      500

      0/30

      0

      未见明显异常

      1000

      0/30

      0

      未见明显异常

      2000

      11/30

      36.7

      死亡11

      4000

      30/30

      100

      全部死亡

       

      2.4 HEpep的抗疲劳作用评价

      亚硫酸钠可以与水中的溶解氧发生反应,造成环境中缺氧,斑马鱼在缺氧环境中造成疲劳,因此常用于疲劳造模[13]。运动耐力实验是反映机体疲劳最直接、最客观的指标,是机体运动过程中物质代谢和能量代谢的综合体现[14]

      阳性对照药中华跌打丸由金不换、半边莲等数十种中草药组成, 具有消肿止痛、舒筋活络、止血生肌、活血驱风的功效[15]从表4中可知,模型对照组斑马鱼总运动距离(2622 mm)与正常对照组(6505 mm)比较,说明疲劳斑马鱼模型构建成功;阳性对照药中华跌打丸组(1 mg/mL)斑马鱼总运动距离为7097 mm,与模型对照组比较其运动改善作用为115.2%。根据图2所示,中华跌打丸组斑马鱼运动后体内乳酸含量最低(0.003 mmol/g),与模型对照组比较(乳酸含量 0.092 mmol/g),乳酸含量降低 97%,说明中华跌打丸可显著改善亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼运动能力, 降低体内乳酸含量。此结果与高华等人的研究结果一致:中华跌打丸能明显延长小鼠负重游泳时间, 降低运动后血清尿素氮的含量, 加快运动后血清乳酸的消除速率, 对缓解机体运动中的疲劳感有积极的作用[16]

      HEpep 1113331000 μg/mL浓度组斑马鱼总运动距离分别为543932802697 mm,与模型对照组(2622 mm)比较,其运动改善作用分别为72.5%16.9%1.9% HEpep处理后斑马鱼运动后体内乳酸含量分别为0.0340.075 0.087 mmol/g(图2),与模型对照组比较,乳酸含量分别降低63.2%18.8% 5.1%。说明在本实验浓度条件下,HEpep对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼运动能力有明显的改善作用,而且当HEpep浓度为111μg/mL时,该作用最明显,乳酸含量降低率也最大。当HEpep浓度大于111 μg/mL时(3331000 μg/m),对疲劳斑马鱼运动改善作用呈现减弱趋势,运动后斑马鱼体内乳酸累积量也呈现上升趋势。该结果提示 HEpep作为疲劳改善剂使用时,适宜浓度范围为 0 - 111 μg/mL,并非剂量越大越好。根据HEpepGPC分子量分析结果显示,分子量668以及303的肽段占比最大,分别占25%以及48%。研究发现,小分子肽在人体不需消化可直接吸收,能直接参与蛋白质的合成[17]。蛋清蛋白通过酶解作用也可产生具备抗氧化活性的氨基酸,包括半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸等[18],可清除体内超氧阴离子和羟基自由基(·OH),维持机体氧化还原平衡[19],降低疲劳感。根据表2结果,HEpep中具有抗疲劳功效的支链氨基酸(亮氨酸+异亮氨酸+缬氨酸)含量高达15.93 mg/g,可能是HEpep对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼运动能力有明显的改善作用的原因。

      4 HEpep 对疲劳斑马鱼运动能力的影响(n=10

      Table 4 Effect of HEpep on exercise ability of fatigue zebrafishn=10

      组别

      浓度(μg/mL

      斑马鱼1   h运动总距离

      mmmean ± SE

      运动能力改善作用(%

      正常对照组

      -

      6505 ± 314

      -

      模型对照组

      -

      2622 ± 473

      -

      中华跌打丸

      1 mg/mL

      7097 ± 551***

      115.2***

      HEpep

      111

      5439 ± 386***

      72.5***

      333

      3280 ± 379

      16.9

      1000

      2697 ± 461

      1.9

      与模型对照组比较:***p < 0.001

      clip_image003.png

      2 HEpep 对疲劳斑马鱼体内乳酸含量的影响 (p < 0.05)n=10

      Fig.2 Effect of HEpep on lactic acid content in fatigue zebrafish (p < 0.05)n=10

      3  结论

      在本研究中,鸡蛋清水解物HEpep支链氨基酸(亮氨酸+异亮氨酸+缬氨酸)含量丰富,高达15.93 mg/g对于亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼,在1113331000 μg/mL的浓度条件下,其运动改善作用分别为72.5%16.9%1.9%乳酸含量分别降低63.2%18.8%5.1%HEpep对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼运动能力有明显的改善作用,HEpep作为疲劳改善剂使用时,适宜浓度范围为 0 - 111 μg/mL

      参考文献

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